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Parametri chimici fisici e biologici del liquido di dialisi
Tagliavini Dante Centro Dialisi Istituto di Clinica Medica e Nefrologia Ospedale Maggiore Parma.

Introduzione
Con il termine "liquido di dialisi" (l.d.d.) possiamo intendere, in generale, ogni soluzione polisalina usata in dialisi, per rinormalizzare l'equilibrio elettrolitico e acido base e per rendere possibile la rimozione dei cataboliti terminali. In questa ampia definizione rientrano, quindi, anche i liquidi di reinfusione usati in emofiltrazione (HF) ed Emodiafiltrazione (HDF). Fisseremo comunque l'attenzione sul l.d.d. con bicarbonato, usato in emodialisi diffusiva (HD) in HDF, o in HF (come liquido di reinfusione quando prodotto dall'apparecchio di dialisi). Molti dei concetti esposti si applicano però anche agli altri casi. Per poter svolgere il suo ruolo in modo ottimale, il l.d.d. deve avere una ben precisa composizione chimica e rispondere a determinati requisiti di purezza sotto l'aspetto microbiologico e dei microinquinanti chimici. Inoltre la sua preparazione, a partire da soluzioni concentrate, e/o il controllo implicano in genere misure conducimetriche. Di qui l'aspetto fisico della questione.

Parametri chimici - Liquido di dialisi a bicarbonato - Unità di misura
Ogni l.d.d. ha la sua formula nominale, stabilita dal medico, che individua quali soluti e in che quantità si debbano avere in soluzione. In genere abbiamo:

  • Cationi: Na+, K+, Ca++, Mg++
  • Anioni: Cl , HCO3 (bicarb.), CH3 - COO (acetato)
  • Molecole neutre: CO2 e[GT1], a volte, glucosio.

Questa formulazione implica necessariamente l'inevitabile presenza, anche se in piccola, ma a volte non trascurabile quantita', di CO3 (ione carbonato), Ca CO3 (carbonato di calcio) e, trattandosi di soluzioni acquose, di H+ e OH-. L'unità di misura più naturale in chimica per quantificare la concentrazione di un soluto è la mole/litro (mol/l) o il suo sottomultiplo millimole/litro (mmol/l). La mole, diversamente dal peso, esprime il numero di unità chimiche (molecole, atomi, ioni) della stessa specie, presenti in una data quantità di sostanza. Così una mole d'acqua contiene lo stesso numero di molecole di una mole di glucosio; tale numero, detto numero di Avogadro N, è pari a 6,02 · 1023 Importante è poi il legame tra moli e grammi. Se si tratta di molecole, una mole è pari a un numero di grammi uguale al peso molecolare (p.m.). Così essendo il p.m. dell'acqua 18, una mole d'acqua pesa 18 gr.. Analogamente per gli atomi e ioni: ad es. essendo 23 il peso atomico (p.a.), del sodio, una mole di sodio è pari a 23 gr. e 1 mmol è pari a 23 mg
Perciò:

  • moli (ioni o atomi) = grammi/ p.a.
  • moli (molecole) = grammi/p.m.

A volte, per gli ioni, invece delle moli si parla di equivalenti. Mentre la mole si riferisce al numero di ioni, l'equivalente (eq.) si riferisce al numero di cariche elementari (carica dell'elettrone) complessivamente portate dagli ioni. Quindi avrò l'equivalente di ioni se il numero totale di cariche trasportate è pari al numero di Avogadro N. La relazione tra moli ed equivalenti è così:

  • n° equivalenti (ioni)=n° moli x carica dello ione.

Perciò per il Ca++, che ha 2 cariche, abbiamo:

  • 2 eq. di Ca++=1 mol di Ca++.

Per i trasporti d'acqua a livello di membrane naturali ed artificiali, dovuti ai soluti presenti (osmosi), e importante il concetto di osmole: l'osmole si correla al totale di tutte le particelle presenti in soluzione, quale che sia la specie cui appartengono: 1 osmole è pari ad un numero di particelle uguale al numero di Avogadro N. Così sciogliendo 1 mole di NaCl in acqua, dato che il sale si scompone (ionizza) in Na+ e Cl-, si avrà anche 1 eq. di Na+, 1 eq. di Cl e 2 Osmoli, poiché, per ogni molecola di NaCl, si hanno due particelle in soluzione: Na+ e Cl-. Quando scriveremo una specie chimica tra parentesi quadra, come ad es. [Na+], [CO2], intenderemo la sua concentrazione in mol/l. o, se specificato, mmol/l.

Il pH
Altro parametro importante per il l.d.d. con bicarbonato è il suo pH. Il pH è un modo comodo per esprimere la concentrazione [H+] degli ioni in soluzione, che, se la soluzione è diluita, può andare da un massimo di circa 0,1 moli/l fino a valori piccolissimi dell'ordine delle 10-14 mol/l. Per evitare di dover usare numeri così poco maneggevoli, la concentrazione di ioni idrogeno viene espressa con il pH, così definito:

  • pH= -10g10 [H+].

Il segno - serve solo per avere dei valori positivi per il pH. Per soluzioni diluite esso varia così da 1 ( [ H+]=0,1 mol/l) a 14 ([H+]=10-14 mol/1). In una soluzione acquosa diluita [H+] · [OH] =Kw (costante), cosicché se [H+] aumenta [OH] deve diminuire e viceversa. A 22°C Kw = 10-14 (mol ) 2 . Se la soluzione è neutra, come nel caso dell'acqua pura, allora [H+]=[OH ] e pH=7. Se acida, [H+] > [0H], pH < 7 e, se basica, [H+] < [0H ], pH > 7. L'importanza del pH in fisiologia, discende già dalla constatazione, che l'organismo umano possiede tutta una serie di sistemi per mantenere, in condizioni normali, il pH ematico entro i limiti molto ristretti di 7,35 e 7,43. Situazioni di estrema gravità si hanno se il pH scende a 7,0 o se sale oltre il 7,8. Questo però non implica, che se si dializza con un l.d.d. con pH=7,0, ciò metta necessariamente in pericolo il paziente. La questione è più complessa e la chiariremo nel prossimo paragrafo, dove emergerà anche che il pH del l.d.d. è un elemento di giudizio sulla sua qualità e il suo monitoraggio una sicurezza contro grossolani errori sui concentrati o gravi difetti tecnici dell'apparecchiatura.

L'acido carbonico, le sue forme e il pH della soluzione
Il pH del l.d.d., così come del plasma, è determinato essenzialmente dalle concentrazioni [HCO3 ] dei bicarbonati e [CO2] della anidride carbonica in soluzione, secondo 1 'equazione di Henderson-Hasselbalch

  • pH=pK1 + log10 HCO3]/ [CO2]

dove pK1 è una costante, detta di protonazione, dell'acido carbonico. Nel plasma pK1=6,1, [CO2] va da 1,24 mmol/l (arteriosa) a 1,43 mmol/l (venosa) mentre [HCO3]=25 mmol/l (in condizioni normali). Nel l.d.d. il pK1 è poco diverso da quello del plasma, invece la [CO2] va da 3 a 5 mmol/l e [HC03] in generale da 30 a 40 mmol/l, valori più elevati, in entrambi i casi, di quelli fisiologici. Per i bicarbonati ciò è giustificato dalla necessità di reintegrare i bicarbonati plasmatici consumati nel periodo interdialitico. Per la CO2 al fine di avere un pH sufficientemente basso da impedire, o quantomeno rendere trascurabile, la precipitazione del calcio carbonato (CaCO3). Complessivamente, quindi, al paziente vengono forniti, durante la dialisi, sia bicarbonati che anidride carbonica, ma mentre l'eccesso di quest'ultima viene rapidamente eliminato con la ventilazione polmonare, i bicarbonati restano e il pH plasmatico sale, anche se il l.d.d. avesse avuto un pH inferiore a quello fisiologico. Da un punto di vista chimico, il principale problema posto dal l.d.d. con bicarbonato è la sua instabilità. Due sono le cause: le possibili perdite di CO2 e la scarsissima solubilità dal calcio carbonato. La presenza di HCO3 implica necessariamente la simultanea presenza di CO--3, poiché ha luogo la reazione di dissociazione parziale:

  • HCO3 ---> CO3 + H

ma, contemporaneamente, se [CO3-- ] è sufficientemente elevata, si ha anche:

  • Ca + CO3 ---> Ca Co3

ovvero la formazione e successiva precipitazione di calcio carbonato. Per contrastare quest'ultimo processo si introduce una adeguata quantità di CO2, che ha l'effetto di aumentare gli ioni idrogeno e, di conseguenza, ridurre gli ioni carbonato. La CO2 viene prodotta al momento della preparazione del l.d.d. facendo reagire acido acetico, proveniente dal concentrato acido, con una piccola quota di bicarbonato di sodio, proveniente dal concentrato basico. Ma il concentrato basico, come tutte le soluzioni di bicarbonato, contiene necessariamente anche CO2 e carbonati e la quota relativa del carbonato è tanto maggiore quanto più alto è il pH della soluzione concentrata (Fig. 1).

fig.1

Ne consegue che il valore finale della CO2 nel l.d.d. risulta fortemente condizionato dal valore del pH della soluzione basica. Ad esempio, utilizzando un concentrato basico 1 mole/l nominale di bicarbonato di sodio, per avere un l.d.d. con 35 mmol/l nominali di bicarbonato e 4 mmol/l nominali di CO2, se il pH del concentrato è di 7,8, la CO2 reale sarà effettivamente 4, ma se il pH fosse 8,4 la CO2 reale sarebbe meno della metà: 1,9. Altre perdite di CO2, si hanno poi all'interno dell'apparecchio di dialisi, causa i trattamenti fisici, come la degasificazione, che il l.d.d. può subire. Secondo alcuni autori, per minimizzare la formazione di carbonato di calcio, con l.d.d. contenenti fino a 2 mmol/l di calcio e da 30 a 40 mmol/l di bicarbonati, il pH finale non dovrebbe superare il valore di 7,3. La tabella seguente dà il valore teorico del pH di alcune formulazioni nel caso che il l.d.d. rispetti i valori nominali.

  1. Valori nominali: [HCO3- )=35; [CO2 ]=4; pH=7,1
  2. Valori nominali: [HCO3- ]=34; [CO2 ]=3; pH=7,2
  3. Valori nominali: [HCO3- ]=31; [CO2 ]=5; pH=6,95

La figura 2 invece mostra cosa accada, teoricamente, ad un l.d.d. che, per qualunque motivo, perda CO2 (si è considerato solo la variazione delle diverse forme dell'acido carbonico, trascurando l'inevitabile reazione con il calcio, se presente). Da rilevare come il calo della CO2 e la forte crescita dei carbonati si accompagnino all'aumento del pH. Altrettanto interessante è la stabilità del valore dei bicarbonati in un ampio range di pH, punto su cui non tutti gli autori concordano.

fig.2

I microinquinanti chimici
Nel l.d.d., accanto ai soluti necessariamente presenti, in base alla formula nominale adottata, si trovano anche, in minime quantit&brvbar;, sostanze chimiche indesiderate, i microinquinanti chimici. E' praticamente impossibile evitarli, ma si può, e si deve, tenere la loro concentrazione a valori sufficientemente bassi da non determinare effetti clinici negativi, né a breve né a lungo termine. Essi provengono dall'acqua utilizzata dagli apparecchi di dialisi, dai concentrati e, in particolari condizioni sfavorevoli, dalle stesse attrezzature di dialisi. Sono sostanze chimiche a basso peso molecolare, in grado quindi, di attraversare tutti i tipi di filtri usati in dialisi. Salvo per pochi casi (es. alluminio), non sono a conoscenza dell'esistenza di norme riportanti sistematicamente le CMA (concentrazioni massime ammissibili) per tutti i microinquinanti del l.d.d., quindi riporterò qui le CMA per l'acqua di dialisi (acqua osmotizzata e/o demineralizzata)tratte dalla EUR PHAR. Parte IIa 16 fascicolo IIa edizione 1992, o, in difetto, dalla AAMI. Non è una lista completa, ma riguarda quei microinquinanti che dovrebbero essere assolutamente controllati. A fianco di alcuni sono riportate anche, schematicamente, le conseguenze cliniche. Le CMA sono tutte espresse in p.p.m. (parti per milione ovvero mg/lt).

MICROINOUINANTE
CMA
SINTOMATOLOGIA DA ECCESSO
Cloro libero
0,1 ppm
Fluoro
0,2 ppm
Nitrati (N03 )
2 ppm
Grave meta emoglobinemia, ipotensione, nausea
Solfati
50 ppm
Nausea, vomito, acidosi metabolica
NH4
0,2 ppm
Alluminio
0,01 ppm
Mercurio
0,001 ppm
Piombo
0,01 ppm
Zinco
0,1 ppm
Nausea, vomito, anemia marcata
Rame
0,1 ppm
Emolisi, leucocitosi, pancreatite. Può essere fatale
Composti organo-alogenati
0,03 ppm (totale)
alogenati
0,03 ppm (totale)
Cloroamine
0,05 ppm
Anemia emolitica

Date le esigue concentrazioni, eventuali sfondamenti delle CMA non sono rivelati dall'apparecchio di dialisi, neppure dal pH, e poco si può controllare in reparto (ad. es. il cloro libero e le cloroamine). E' necessaria quindi una analisi periodica delle potenziali fonti, particolarmente dell'acqua di dialisi.

Parametri fisici: la conducibilità
La conduttività del l.d.d. è il parametro fisico più importante. Infatti gli apparecchi di dialisi non sono in grado di misurare direttamente la concentrazione dei sali disciolti e preparano e/o controllano la corretta diluizione solo indirettamente, basandosi su misure di conduttività del l.d.d. Questa tecnica si basa sul fatto, ben noto, che sciogliendo in acqua distillata, di per sé isolante, un sale, la soluzione che si ottiene diventa conduttrice, tanto più, quanto più elevata è la concentrazione del sale. Per rendere il discorso più esatto e quantitativo è bene ricordare le definizioni delle grandezze elettriche in gioco. Ci baseremo, per terminologia e i simboli, sulle norme IEO 743-3 1985. Se in una soluzione contenente ioni, si determina in un qualunque modo un campo elettrico E, si ha un movimento di cariche positive nel verso di E, e negative nel verso opposto. Si ha cioè una corrente, che risulta essere legata ad E dalla semplice relazione

  • J=x · E.

J è la corrente che attraversa l'unità di superficie perpendicolare ad E, e si misura in A/m2; x (kappa) è una costante detta conduttività (o conducibilità specifica), che dipende solo dalla soluzione e dalla sua temperatura. La sua unità di misura è Siemens/m, ma in dialisi è più usato il suo sottomultiplo (fattore 10) milli Siemens/cm (mS/cm) La dipendenza di x dalla temperatura, nello stretto range usato in dialisi ( 35° - 40° ) è con buona approssimazione lineare:

  • x=xtr · [l +(· (t - tr )]

Dove xtr è riferita alla temperatura di riferimento tr (solitamente 25°C) mentre x è riferita alla temperatura t. La costante ( è denominata coefficiente di temperatura. Frequentemente è dato ( (%)=l00 · (, che esprime la percentuale di variazione di x per ogni grado di temperatura. La determinazione di ( (%) del l.d.d. non è agevole e non c'è al riguardo pieno accordo; comunque si tratta di un valore che va dal 1,8% al 2,5%. Ogni ditta fa la sua scelta e tara, su questa, i suoi conduttivimetri. La necessità di tenere conto della dipendenza dalla temperatura, è evidente se si tiene presente che con ( (%)=2%, nel range di 5°C tra 35°C e 40°C, la variazione della conduttività sarebbe del 10%. Se non si compensasse l'effetto della temperatura, potremmo avere nel bagno di dialisi delle inaccettabili variazioni del 10% nella concentrazione salina. Il risultato finale, usato per le misure conduttivimetriche da correlare al l.d.d., e quindi x25°, in modo da avere una grandezza dipendente solo dal l.d.d. e non dalla sua temperatura. In pratica, l'apparecchio di dialisi misura innanzitutto la conduttanza G di una cella conducimetrica (un contenitore, con due elettrodi, attraversato dal l.d.d.)

  • G=U /12

applicando agli elettrodi della cella una tensione U e misurando la corrente I. La conduttività risulta poi proporzionale alla conduttanza G

  • x= Kcella · G,

Kcella essendo una costante nota, dipendente solo dalla geometria della cella (Kcella si misura in cm-1 e G in Siemens o milli Siemens). Una misura di temperatura del l.d.d. permette poi di passare a x25°. Alla cella viene applicata una corrente alternata di frequenza sufficientemente elevata (500 - 2.000 HZ in genere) da evitare fenomeni di scarica agli elettrodi, che renderebbero non lineare il legame tra U e I, falsando quindi il calcolo di G. La conduttività a 25° del l.d.d. è determinata dal contributo di tutti gli ioni presenti in soluzione. In altre parole, anche se il Na* e il Cl- sono gli ioni presenti in maggiore quantità, non esiste una esatta correlazione tra essi e la conduttività. Per ogni formulazione di liquido di dialisi vi è una ben precisa conduttività a 25°. Questa deve essere nota e usata come riferimento per la regolazione e taratura delle apparecchiature. E' bene poi tenere presente, specialmente per misure di laboratorio, che il legame tra la conduttività e la concentrazione salina non è lineare. Anche se abbiamo una soluzione di un solo sale (es. NaCl), se dimezziamo la concentrazione la conduttività che otterremo sarà maggiore della metà di quella iniziale. Solo per valori di conduttività inferiori ai 0,1 mS/cm la relazione è lineare entro l'1%.

Parametri biologici
Il l.d.d. può essere contaminato, da un punto di vista biologico, da vari microrganismi: batteri, funghi, virus e dai loro prodotti: i pirogeni. Sono questi, un gruppo eterogeneo di molecole organiche, il cui peso molecolare oscilla tra i 200 a 1 milione circa. Si dividono sostanzialmente in due gruppi:

  1. Endotossine: sono prodotte dalla lisi di batteri morti
  2. Esotossine: sono secrete attivamente da batteri vivi.

Le concentrazioni massime ammissibili (CMA) per i contaminanti biologici dipendono dall'uso che si fa del l.d.d. Per cui, mentre in HF il liquido deve essere sterile ed apirogeno, per l'HD ciò non è strettamente necessario e la cosa va valutata anche in base ai mezzi che si hanno a disposizione, però sempre rispettando la normativa al riguardo. Dalla normativa internazionale si possono ricavare le seguenti CMA per l'HD:

BATTERI H20 dialisi / 100 (CFU / ml) l.d.d.(HD) / 1.000 (CFU/ml)
PIROGENI 0,25 I.U. (LAL Test)

Riguardo ai batteri devono però essere assenti i Coliformi totali e fecali, gli Streptococchi fecali e i Clostridi. Non ho trovato dati per i pirogeni nel l.d.d. (HD). Credo comunque molto importante focalizzare l'attenzione sui pirogeni per i seguenti motivi:

  1. Gli effetti clinici sul paziente, salvo casi eccezionali, sono dovuti ai pirogeni. Anche perché la membrana integra del filtro di dialisi è una barriera insormontabile sia per i batteri che per i virus, anche i più piccoli. Non così per i pirogeni tra i quali troviamo molecole molto piccole (fino a 200 di p.m.).
  2. Un l.d.d. potrebbe avere carica batterica bassa ma elevato livello di pirogeni. Ciò è legato al fatto che le normali conte batteriche fatte in coltura misurano praticamente il numero dei batteri vivi, mentre gran parte dei pirogeni proviene dalla lisi dei batteri morti.
    Il test più comune per i pirogeni è il LAL test (limulus amoebocyte lisate). E' un test relativamente semplice e può essere effettuato direttamente dal personale del centro dialisi. Alcuni pirogeni però, tra cui quelli rilasciati da batteri comuni nell'acqua come lo Pseudomonas, non sono rivelati da questo test. Per un affinamento della ricerca sono disponibili test più complessi come l'MNC test (mononuclear cells test).

Misure e metologie
Le possibili misure chimiche e fisiche sul l.d.d. riguardano:

  • Na+, K+ ,HCO3- ,PH ,Ca++ ,CO2 ,x25° .

Il medico responsabile della terapia dialitica dovrebbe fornire i valori nominali (ottimali) per questi parametri e, molto importante, le oscillazioni ammissibili. In base a queste ultime il tecnico valuta il livello di precisione necessario nelle sue misure. Ad es. se l'oscillazione ammissibile per l'Na è del 2% ( ± 3 mEq/lt circa), il tecnico, per avere un minimo margine di manovra, dovrà effettuare delle misure con un errore non superiore all'1%. E non è affatto facile. Infatti, per le misure di cui ci occupiamo, vi sono almeno quattro sorgenti di errore: la modalità del prelievo, l'instabilità del l.d.d. verso alcuni parametri (es. pH, CO2), la strumentazione usata ed infine le soluzioni standard per tarare gli apparecchi di misura. Per la modalità corretta del prelievo occorre tenere ben presente come opera l'apparecchio di dialisi in esame. In via generale e per apparecchi in single-pass, in laboratorio, può essere utilizzata la metodologia illustrata nella figura 3. Il tratto di circuito illustrato è connesso all'apparecchio al posto del filtro di dialisi. La camera di miscelazione da 500 ml circa serve a mediare eventuali oscillazioni nella concentrazione del l.d.d. Ad essa segue un punto di prelievo per siringa (senza ago), particolarmente indicato per misurare, con emogasanalisi, il pH e la CO2 e, con gli ioni selettivi, il Ca++. Il Na+ e il K+ è bene siano misurati con il fotometro a fiamma, utilizzando il prelievo con siringa oppure il liquido che resta nella camera di miscelazione una volta disinserita dall'apparecchio.

fig.3

La camera di miscelazione fornisce poi liquido sufficiente per misurare i bicarbonati con la titolazione con HCl e metilarancio come indicatore. A valle, nel circuito di controllo, c'Ë poi un conducimetro con termometro per il rilievo dei parametri fisici. E' possibile anche inserire una sonda pH in linea per la misura in tempo reale.
L'instabilit&brvbar; del l.d.d. con bicarbonato puÚ influenzare il pH, i bicarbonati, l'anidride carbonica e il calcio ionizzato. Quindi le misure di questi parametri, per avere la massima precisione, dovrebbero essere effettuate immediatamente dopo il prelievo. In realtà operando con contenitori ben chiusi e completamente pieni di l.d.d., è possibile fare alcune delle suddette misure anche un'ora dopo con piccoli errori. E' facile fare esperienza personale al riguardo facendo successive misure su uno stesso campione di l.d.d.. La precisione degli strumenti e degli standard usati per tararli è basilare. Innanzitutto gli standard devono avere valori prossimi il più possibile ai valori che si vogliono misurare e il loro grado di precisione deve essere adeguato. Per il sodio e il potassio ad esempio, valori ragionevoli per lo standard potrebbero essere

  • Na=140 ± 0,5 mEq/lt K=3,00 ± 0,03 mEq/lt

in soluzione acquosa (lo standard per il plasma può dare problemi). Poter poi disporre di standard a diversi valori per un dato parametro permette di valutare anche la precisione dello strumento (la sua linearità ad esempio). Una nota a parte è necessaria per la misura dei bicarbonati con la titolazione con HCI. Usando il metilarancio come indicatore, si misurano sia i bicarbonati che gli acetati. E' quindi necessario togliere al risultato della misura la concentrazione nominale degli acetati. Inoltre il metodo non distingue i bicarbonati dai carbonati. E' quindi necessaria anche la misura del pH del l.d.d. per accertarsi che i carbonati siano presenti in quantità trascurabile (vedi grafico Fig. 2). Per le misure conducimetriche il problema degli standard è più complesso che per le misure di concentrazione, in quanto la relazione tra concentrazione e conducimetria non è lineare. Ciò implica che, nota la formula per uno standard di dato valore di conduttività, non ne posso derivare quella per un altro valore con una semplice proporzione. Lo standard che mi è noto essere il più vicino ai valori usati per il l.d.d. è il seguente della IEC:

  • Soluzione KCl 7,4365 gr/lt soluzione cui corrisponde una conduttività x25°=12,856 ms/cm Il potassio cloruro (KCl) prima di essere pesato deve essere preventivamente seccato a 220° - 240°C per 2 ore.